iPS人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞AC-2001001

iPS人誘導(dǎo)多能細(xì)胞

規(guī)格：1×10⁶ cells/管

活細(xì)胞運(yùn)輸：收到細(xì)胞后，請(qǐng)立即放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

凍存細(xì)胞運(yùn)輸：可暫存于-80℃冰箱或液氮長期儲(chǔ)存。

產(chǎn)品簡介： 

iPS人誘導(dǎo)多能細(xì)胞產(chǎn)品是利用病毒載體將四因子系統(tǒng)(Oct4、Sox2、 Klf4 、c-Myc)轉(zhuǎn)入皮膚成纖維細(xì)胞（成年女性）將其誘導(dǎo)重編程為iPS細(xì)胞，且對(duì)iPS細(xì)胞進(jìn)行分化及干細(xì)胞marker鑒定。該產(chǎn)品采用埃澤思生物的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（AC-1001000/AC-1001001）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)與傳代。本產(chǎn)品經(jīng)檢測人iPS細(xì)胞無細(xì)菌、真菌、霉菌、支原體污染。

產(chǎn)品組成：

實(shí)驗(yàn)材料

H1人胚胎干細(xì)胞系（Applied Cell^?: Cat. no.AC-2001002）

H9人胚胎干細(xì)胞系（Applied Cell^?: Cat. no.AC-2001003）

人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（Applied Cell^?: Cat. no. AC-1001000）

Advance人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（Applied Cell^?: Cat. no. AC-1001001）

即用型基質(zhì)膠（Applied Cell^?: Cat. no.AC-1001007）

人多能干細(xì)胞消化液（Applied Cell^?: Cat. no.AC-1001008）

Serum-Free干細(xì)胞凍存液（Applied Cell^?: Cat. no.AC-1001012）

磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline，PBS)

操作方法（以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作）

iPS人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞復(fù)蘇操作：

1. 實(shí)驗(yàn)操作步驟：

1.1  基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1 mL/0.5 mL即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，實(shí)驗(yàn)前拿出并置于超凈工作臺(tái)/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時(shí)不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 儲(chǔ)存，并于1周內(nèi)使用。

注意：①一支凍存的干細(xì)胞的數(shù)量在1×10⁶cells/mL左右，對(duì)應(yīng)6孔板1孔；②即用型基質(zhì)膠對(duì)溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2  先將2~3mL的干細(xì)胞培養(yǎng)基加入15mL離心管中備用。

1.3  解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動(dòng)，使其在1~2min內(nèi)快速解凍；

注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時(shí)間。

1.4  離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細(xì)胞培養(yǎng)基的15mL離心管中，將15mL離心管置于低速離心機(jī)中配比平衡后，1000rpm離心3min；

1.5  重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。

1.6  接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)包被好的6孔板中，并補(bǔ)全每孔2mL培養(yǎng)體系。

1.7  培養(yǎng)：接種后的6孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈4個(gè)細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于37℃，5% CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細(xì)胞貼壁情況；

1.8  換液：從復(fù)蘇的時(shí)間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

iPS人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞傳代

2.  實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：

2.1 清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入1 mL PBS緩沖液并輕輕晃動(dòng)，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS緩沖液；

2.2  消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于37℃培養(yǎng)箱中2~5 min；

注意：消化時(shí)間依據(jù)干細(xì)胞生長密度，消化時(shí)間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)一般建議時(shí)間2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3  吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打3~5次，使皿底干細(xì)胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正常現(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長消化時(shí)間。

2.4  離心：1000rpm離心3min；

2.5  接種：棄上清，用干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打細(xì)胞5-10次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補(bǔ)全每孔2mL的培養(yǎng)體系。

注意：吹打細(xì)胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過10次，并且

2.6  換液：從傳代的時(shí)間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

iPS人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞凍存

3. 實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：

3.1  清洗：同2.1；

3.2  消化：同2.2；

3.3  吹打：同2.3；

3.4  離心：同2.4；

3.5  重懸：離心后棄上清，加入2 mL Serum-Free干細(xì)胞凍存液（AC- 1001012）對(duì)干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次后，將其加入到凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時(shí)放回4℃冰箱。

3.6  記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時(shí)間、操作者及細(xì)胞批次。

3.7  -80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。

 注意：凍存管放置于-80℃冰箱時(shí)，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.8  液氮凍存：24小時(shí)后將-80℃冰箱中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存。

 圖1 人iPS細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)圖 100×                                                       圖2 人iPS細(xì)胞熒光染色圖 200×  

質(zhì)檢控制